发酵企业一般当发酵产量下降时,怀疑噬菌体污染问题。证明细菌:将发酵液拿来做菌株纯化,看看有没有杂菌落,若有可疑菌落,进一步镜检因此可以得证杂菌污染。否则怀疑噬菌体污染。
噬菌体污染:一般如果为烈性噬菌体污染很好判断(发酵液不能增菌) 但污染了温和噬菌体就很难处理。
证明:拿已知的原始菌株(无噬菌体感染的)作为寄主做平板涂布,将发酵液直接点植在平板上,并做好位置。记号,培养观察,在点植处若出现半透明噬菌斑,那肯定是温和噬菌体污染了。
噬菌体污染往往是先从发酵罐开始的,然后才波及到种子罐。如果细心观察可以发现,当你的发酵罐不正常的时候往往种子罐的种子在镜检时也有异常菌体出现。
通气发酵,空气过滤器对噬菌体的截留能力不一定很好。一般噬菌体要比空气过滤器的孔径还小的多,能够完全进入到发酵罐中。一般发酵罐的通气量要比种子罐大,所以也会导致发酵罐比种子罐提前表现出来。
噬菌体防治是个很头疼的问题,涉及到菌种、空气、环境、设备等等。积极的方法是选育抗噬菌株。但在平时也,应该做好环境的消毒工作。消毒重点在于发酵罐,管路,及空间。
噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒,其个体形态极其微小,用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解,释放出大量子代噬菌体,然后它们再扩散和侵染周围细胞,终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清,或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性,快速检查、分离,并进行效价测定,对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
发酵过程中噬菌体感染问题
1 噬菌体
噬菌体是侵染细菌的微生物病毒,广泛分布于自然界中。在生产中见到的噬菌体为蝌蚪形,直径约0.1um,其形态在显微镜下看不见,通过电子显微镜放大9×104倍后才能看见。故在生产中平时对噬菌体看不见摸不着,无形之中增加了对其了解和预防的难度。
2 噬菌体的主要特性
2.1专一的寄生性。噬菌体只能在专一的宿主细胞中生长繁殖,只能在活的、处于繁殖阶段的细胞中生长繁殖,不能脱离宿生而自行生长繁殖。如果不同菌株的亲缘关系比较近,那么此菌株也是会感染的,特别是针对长期生产同一产品的发酵工厂要特别注意,在换新菌株之前必须了解其背景。
2.2不耐热性。游离的噬菌体在45℃条件下10min就可使其失活。
2.3不耐药性。直接在噬菌体上喷洒1%新洁尔灭、75%酒精、1%双氧水、5%的甲醛等都可使其失活。
3 感染噬菌体后的现象
噬菌体分烈性噬菌体和温和性噬菌体,温和性噬菌体由于其潜在的危害性大,有时候感染了,但不爆发,为以后的大面积爆发埋下了隐患。在从事发酵工作时就遇到,车间周围环境恶化的已经相当厉害,仅一个星期中上的罐中有75%罐都爆发了噬菌体,除了一罐以外,且表观中基本看不出染噬菌体的现象,而电镜观察是能看到噬菌体存在的。
感染后爆发的现象有:
3.1发酵液光密度开始上升,而后下降。但有时也不上升,当把1%的噬菌体人为的接入罐中,光密度始终处于低位
3.2 pH逐渐上升,一般升到7.5,不再下降
3.3耗糖、氨缓慢或停止
3.4 OD回升
3.5泡沫大、料液略黏
3.6镜检时发现菌体减少,发胖,革兰氏染色后呈现红色碎片。严重时,可出现拉丝或网状,或呈鱼刺状,几乎看不到完整菌体。
3.7用含有噬菌体的发酵液点在平板上能看到噬菌斑
一旦发酵菌浸染噬菌体后,就要从菌种,培养基,环境,发酵系统管路,地沟,污水池,排风口等进行全面的消毒排查,物理消毒方式通常很难将噬菌体消除,通常需要物理和化学方式相结合处理噬菌体污染。
必要暂停发酵培养工作,对整个发酵环境,管路,器材进行消毒处理,可用紫外灯照射加过氧化氢干雾熏蒸的方式对整个发酵场所进行消毒,在不影响生产的情况,可以停止发酵一个月的时间,让发酵环境的活大肠杆菌消除或减少到低限度。
发酵生产环境或实验室空间化学熏蒸比较安全可靠的方法是过氧化氢气体灭菌方式,代替传染有害有毒的甲醛熏蒸。过氧乙酸和甲醛已被否定,目前流行和被接受的是VHP过氧化氢空间灭菌,其广谱、高效、安全无害,无残留的消毒方法成为新一代选择。在解决发酵生产中预防和防治噬菌体浸染问题具有重大意义,这里需增强防重于治的意识,也就是说需要定期的环境空间全面熏蒸消毒。那么过氧化氢干雾灭菌装置必不可少,因为要经常使用,并且可以短时间内完成消毒,运行成本低,不能造成不良腐蚀影响等。
润联钟成从事发酵生产数十年,熟悉噬菌体污染的综合解决方案,具备丰富的一线操作实践经验,能够彻底杀灭和解决噬菌体问题。依托比利时诺福杀菌产品为用户量身定制符合实际条件的低成本噬菌体污染解决方案。
叠加由自主研发的比林科汉过氧化氢干雾消毒机产品,为解决噬菌体创造了基础硬件设施。比林科汉过氧化氢干雾消毒技术,智能化、数字化、可视化的全自动发酵车间消毒方式广泛受到关注。其采用冷蒸发文丘里干雾技术原理,干雾技术累积十五年,前沿性先进,干雾气体肉眼不可见、无孔不入。
突破性解决了过氧化氢消毒有腐蚀性的普遍问题,取代了VHP汽化过氧化氢、高温闪蒸、电离等高浓度腐蚀性方式,以进口比利时杀菌产品为基础的高活性杀菌、低浓度即可达到的效果。其结合比林科汉干雾消毒机,无与伦比的干雾扩散和自由布朗运动,在出雾颗粒方面,甚至远超同类设备,真正的目中无雾(干雾),不留任何污染的地方,实现更温和的消杀手段和更好的材料兼容性。钟成认为具有以下优点。
1)发酵车间或实验室整体房间快速杀灭噬菌体、病原体,细菌,真菌,霉菌和病毒,广谱的杀菌效果;
2)快速高效省时,当天灭菌即可当天投产使用;
3)杀灭噬菌体效果达到>99.999%,并且是比较彻底全面覆盖;
4)消杀全过程无需人员值守,自动化工作,可在外面远程控制,动态实时监控消杀过程;
5)完整的服务方案及GMP规范指导,完善的效力验证文件及报告。